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母猪流产导致仔猪数量减少，严重影响养猪场生产效率，同时母猪频繁流产还会降低繁殖能力，导致不育，最终被迫淘汰，进一步增加养殖成本。引起母猪流产原因主要包括传染病、遗传以及环境因素等，其中，传染病是最重要因素。能够引起母猪流产的常见传染病包括猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）、猪瘟（Classical swine fever，CSF）、猪伪狂犬病（Pseudorabies，PR）、猪圆环病毒病（Porcine circovirus disease，PCVD）、猪细小病毒病（Porcine parvovirus disease，PPD）、猪流行性乙型脑炎（Japanese encephalitis，JE）、猪弓形体病（Toxoplasmosis）、猪衣原体病、猪布鲁氏菌病以及猪附红细胞体病。
猪弓形体病（Toxoplasmosis）是由刚地弓形虫（Toxoplasma gondii，T.gondii）引起的一种高度流行的人兽共患寄生原虫病，呈世界性分布，可以感染包括人在内的大部分温血脊椎动物。免疫功能正常的个体感染弓形虫绝大多数无明显临床症状，呈隐性感染状态，因而容易被猪场忽视；怀孕母猪感染弓形体可导致流产、早产、弱胎或死胎等，并可通过胎盘垂直传播，因而对仔猪生产带来严重危害。国内不同的研究团队对我国猪场弓形体病进行了流行病学调查，感染率在10%～60%之间。感染率差异可能受诊断试剂、检测方法和样本来源影响，但所有结果均显示我国猪场弓形体病发病率高，临床危害应该得到重视。
2023年7月底至8月，河南信阳某规模化养猪场母猪群出现异常流产，通过对流产母猪血清样本进行抗体和抗原检测，发现弓形体是导致母猪流产的主要病原。在实施药物治疗和针对性的病原体防控措施后，母猪的流产率显著下降，窝均产仔数显著上升。该案例将为我国猪场弓形体病防控提供参考依据。
1、材料和方法
1.1临床病料
2023年7月底至8月，河南信阳某存栏为800头母猪的规模化养猪场发生严重流产事件。该猪场为PRRSV、PRV阴性场。本实验室于8月16日接收了14份临床流产母猪的临床样品，包括7份血清样品和7份由咽拭子、尾根血和胎衣混合液组成的病原样品，旨在检测流产原因。
1.2病毒DNA提取
首先，将收到的临床组织样品置于-80℃冰箱中，进行三次冻融处理。随后，取10 mg组织样品放入2 mL EP管中，加入2颗洁净钢珠和1 mL PBS缓冲液，使用高通量组织研磨仪进行匀浆。匀浆后的样品离心后，取200µL上清用于病毒DNA提取。
本实验使用AXYGEN DNA提取试剂盒进行DNA提取。首先，在200µL病毒悬液中加入200µL Buffer VGB、20µL蛋白酶K和1µL Carrier RNA，充分混匀后在56℃水浴孵育10 min，再加入200µL无水乙醇混匀。将混合液转移至离心柱中，12 000 rpm离心2 min，弃去滤液（可重复一次以提高提取效率）。然后依次加入500µL Buffer RWA和700µL Buffer RWB，每次均以12 000 rpm离心1 min，并弃去滤液。最后，将离心柱置于新的EP管中，加入50µL DEPC水，静置5 min后以12 000 rpm离心2 min，收集洗脱的DNA，并置于-80℃条件下保存。
1.3病毒RNA提取、反转录
在匀浆后的样品离心后，取200µL上清用于病毒RNA提取。本实验采用Trizol法进行RNA提取，步骤如下：在200µL上清中加入300µL RNAiso（TAKARA），混匀后于室温孵育5 min，然后在4℃条件下以12 000×g离心5 min。将上清液移至新的EP管，加入60µL氯仿，震荡混匀后在室温下静置5 min，再次在4℃条件下以12 000×g离心15 min。吸取最上层120µL液体，加入120µL异丙醇沉淀RNA。随后，依次用75%乙醇和100%乙醇在4℃条件下以12 000×g离心10 min清洗RNA沉淀，弃去上清并干燥RNA沉淀。最后，用30µL DEPC水溶解RNA。所得RNA可用于后续反转录或置于-80℃保存备用。
接下来，使用TAKARA的反转录试剂盒进行反转录，具体操作按照说明书进行。反转录完成后，获得的cDNA可用于荧光定量PCR检测。
1.4荧光定量PCR
本实验使用诺唯赞的荧光定量酶对临床样品的CT值进行检测，并依据CT值判断病原是否存在。其中，PRRSV病原的检测使用IDEXX的1-2型多重实时荧光定量PCR检测试剂盒；JEV和PPV的抗原检测使用湖南冠牧生物科技有限公司的抗原检测试剂盒；PCV的抗原检测则采用北京明日达科技发展有限责任公司的抗原检测试剂盒，具体判定标准按说明书执行。ASFV抗原检测根据P72基因设计特异性引物进行检测；弓形体抗原检测采用特异性引物F:TCTCTCTTCAAGCAGCGTAT，R:AGCGTTCGTGGTCAACTATC进行检测。
1.5酶联免疫吸附测定
1.5.1 PRV的酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测（IDEXX）
PRV的ELISA检测采用IDEXX试剂盒进行。首先，按照说明书要求将待测血清样品、阴性对照和阳性对照进行稀释后加入ELISA板中，在37℃条件下孵育1 h。孵育后，清洗ELISA板5次，加入酶标二抗，再孵育30 min。孵育后，再次清洗ELISA板5次，加入TMB显色液并在室温下避光孵育10～15 min，最后加入终止液终止反应。并通过酶标仪在450 nm波长下读取光密度（OD值），计算S/N比值。其中，S/N值＜0.60则被判定为阳性。
1.5.2 PRRSV、PCV2的ELISA检测（MEDIAN）
PRRSV、PCV2的ELISA检测使用MEDIAN ELISA检测试剂盒进行。操作步骤同1.5.1，显色后计算S/P比值。具体判定标准依据说明书执行。
1.6胶体金试纸
本实验采用的ASFV和弓形体胶体金试纸由本实验室研制并保存。具体操作步骤为，将临床血清样品适度稀释后加入加样孔中，10 min后通过观察T线的出现与强度来判断抗体水平：若C线和T线均出现，则判定为阳性；仅出现C线则为阴性；若C线未出现，则实验无效。
2、结果与分析
2.1临床病料核酸检测
对7份包含咽拭子、尾根血和胎衣混合液组成的病原样品提取DNA和RNA，随后将提取的DNA和RNA与血清样品一起储存在-80℃备用。
为明确流产原因，笔者使用荧光定量PCR对病原样本进行PRV、PRRSV、PCV、ASFV、JEV和PPV抗原检测。结果显示，所有样本中PRV、PRRSV、PCV、ASFV、JEV以及PPV抗原检测均为阴性（表1）。
2.2临床血清样品抗体检测
同时，笔者采用ELISA和胶体金试纸对临床血清样品的PRV、PRRSV、PCV2、ASFV抗体进行检测。结果显示，所有样本中PRV、PRRSV以及ASFV抗体检测均为阴性。由于该猪场此前已接种PCV2疫苗，PCV2抗体检测为阳性（表2）。
2.3临床样品弓形体检测
在排除病毒性疾病对该猪场母猪流产的影响后，笔者检测是否为原虫性病原体弓形体感染所导致。笔者使用自研的猪弓形体胶体金试纸对上述血清样本进行了弓形体抗体检测。结果显示，流产母猪血清样品中2、3、5、6、7号样品为弓形体抗体阳性，阳性率为71.4%（5/7）（图1）。
图1临床流产样品弓形体抗体检测结果
同时采用荧光定量PCR检测方法对流产母猪咽拭子、尾根血和胎衣混合液组成的病原样品检测弓形体抗原，结果显示所有样品弓形体抗原均为阳性（图2）。高抗原阳性率（100%）提示弓形体急性感染是导致本次群体性流产的直接原因。
图2临床流产样品弓形体抗原检测结果
2.4猪场疫情控制与持续监测
在对流产母猪血清样品检测中，弓形体的阳性检出率高达71.4%，进一步检测弓形体核酸，显示100%的高抗原阳性率，表明弓形体感染可能是导致该规模化养猪场母猪流产的主要原因。为控制此次疫情并预防猪群流产进一步扩大，猪场对所有流产母猪实施了磺胺嘧啶钠注射等特定防治措施。此外，从2023年9月6日起，猪场对全部猪群进行了为期两周的药物治疗，以全面预防和控制感染。同时，为了减少外界病原体的侵入，猪场采取了驱逐野猫、鸟雀等可能携带病原体的野生动物措施。实施这一系列综合防控措施后，对猪群的流产率和窝均产仔数等进行了持续监测。
监测数据显示，流产事件集中在2023年8月，尤其是该月中旬，流产情况最为严重。在采取了针对措施之后，流产情况显著改善。具体情况如下：2023年7月，1头母猪出现流产；2023年8月，17头母猪出现流产，其中在8月4日，1头母猪出现流产，8月9日，2头母猪出现流产，8月13日，4头母猪出现流产，8月14日，4头母猪出现流产，8月23日，1头母猪出现流产，8月25日，1头母猪出现流产，8月27日，1头母猪出现流产，8月29日，1头母猪出现流产，8月31日，2头母猪出现流产；2023年9月，8头母猪出现流产；2023年10月，3头母猪出现流产；2023年11月，1头母猪出现流产；2023年12月，1头母猪出现流产；2024年1月，未再发生流产事件。
2023年8月流产高峰期，窝均产仔数下降至10.99头。随着针对流产母猪样品检测结果采取防控措施后，窝均产仔数在接下来的几个月出现回升，并在2024年1月达到12头（表3）。
3、讨论与结论
针对河南信阳某规模化养猪场出现的母猪流产情况，笔者和猪场的兽医以及管理人员进行了初步分析。该猪场PRRSV和PRV均为阴性，笔者最初的诊断可能PRRSV或PRV转阳。在对7份流产母猪血清样品和7份由咽拭子、尾根血和胎衣混合液组成的病原样品进行PRRSV和PRV抗体和病毒检测后，排除了这个可能性。本研究进一步对可能引起母猪流产的常见病原包括PCV2、ASFV、JEV以及PPV抗原进行检测，结果均为阴性，排除了这些病毒性病原作为此次流产事件的原因（表1、2）。
猪弓形体病是由刚地弓形虫引起的一种原虫病。其终末宿主是猫，中间宿主包括45种哺乳动物、70种鸟类和5种冷血动物。当弓形虫被终末宿主猫吃后，便在肠壁细胞内开始裂殖生殖，其中有一部分虫体经肠系膜淋巴结到达全身，并发育为滋养体和包囊体。另一部分虫体在小肠内进行大量繁殖，最后变为大配子体和小配子体，大配子体产生雌配子小配子体产生雄配子，雌配子和雄配子结合为合子，合子再发育为卵囊。随猫的粪便排出的卵囊数量很大。当猪或其他动物吃进这些卵囊后，就可引起弓形虫病。该病在5—10月份的温暖季节发病较多。笔者对该猪场进行流行病学调查时注意到该场周边有野猫活动，此次流产事件发生在8月份，猪场所在地河南信阳市该季节温暖潮湿，因而笔者重点检测了猪弓形体病。
此前，笔者团队建立了一个基于猪弓形体主要表面抗原（Surface antigen 1，SAG1）的胶体金抗体检测试纸（专利申请号：202410521442.4）。利用该试纸笔者对采集的流产母猪血清进行了检测，结果显示71.4%的样品呈弓形体抗体阳性，采用PCR方法对流产母猪咽拭子、尾根血和胎衣混合液组成的病原样品检测，抗原阳性率为100%，表明弓形体感染可能是此次母猪流产的主要原因（图1、图2）。其中所有流产母猪均抗原阳性，部分个体可能因免疫抑制或感染窗口期未产生足够抗体。考虑到磺胺类药物是治疗弓形体急性感染阶段的首选药物，在确定病原后，猪场迅速对所有流产母猪注射磺胺嘧啶钠进行药物治疗，并对整个猪群开展为期两周的药物预防，以控制感染扩散。此外，猪场还驱逐了可能携带弓形体病原的野生动物，如野猫和鸟类，以降低外界病原传播的风险。这些综合防控措施取得了显著成效，母猪流产率迅速降低，窝均产仔数明显提高，表明防控措施取得了显著成效（表3）。
本研究报告了一例由弓形体引发母猪流产的案例，提示养猪场在遇到母猪流产时，除了常见的病毒性病原外，需要排除弓形体感染的潜在威胁。
